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Visium 空間轉錄組丨哪些常見問題?這里有你想要的答案!

2020-11-03點擊87次
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Visium 空間轉錄組是在組織原位檢測全轉錄組基因表達的一種技術,使得我們在檢測基因表達水平的同時,獲得基因在組織內部空間表達的位置信息。與空間轉錄組相比,傳統的全基因轉錄組或單細胞轉錄組測序,丟掉了基因或細胞在組織內的空間分布信息,而廣泛應用的 RNA 探針雜交,這只能同時檢測有限的幾個基因在組織內的空間表達分布。而空間轉錄組可以將基因表達與 H &E 染色的結果疊加在一起,不需要對組織進行消化,從而保留了組織內部的空間結構,這樣使得我們可以研究組織內部不同區域的細胞異質性。

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Visium 空間轉錄組的工作原理?

Visium 基因表達玻片上有 4 個捕獲區域,也就是圖片上展示的 4 個小方框,每個捕獲區域的大小是 6.5mm 乘 6.5mm,每個捕獲區域大約有 5000 個 spot,也就是圖上所示的小圓點,每個 spot 的直徑是 55μm,兩個 spot 的中心點的距離是 100μm,每個 spot 上面有數百萬條 oligo。每個 spot 上所有 oligo 的 Spatial Barcode 的序列都是相同的,而不同的 spot 之間 Spatial Barcode 是不同的,這樣通過 Spatial Barcode,就能夠知道每條 mRNA 到底位于哪個 spot,也就獲得了 mRNA 的空間位置信息。UMI 用于基因表達定量,可以知道每個 spot 上有哪些基因表達以及他們的表達量。poly- A 用于捕獲 mRNA。4 個捕獲區域內的 Spatial Barcode 是相同的,但每個捕獲區域內不同的 spot 之間 Spatial Barcode 是不同的。


公司內部空間轉錄組實驗流程?

總實驗流程分為三個部分:           

一是樣本制備及預實驗,二是組織優化,三是基因表達。

樣本制備及預實驗實驗流程:           

首先獲取組織樣本,進行冷凍,OCT 包埋,將包埋好的組織進行冰凍切片,將切好的組織放置于常規玻片上。接下來對組織切片進行固定,H&E 染色,用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片進行明場拍照。同時切 10 片厚度為 10 μm 的冰凍切片,提取 RNA,通過計算 RIN 值來評估其質量。為了獲得最好的實驗結果,建議用 RIN 值大于 7 的組織塊做 Visium 的實驗。

組織優化的實驗流程:          

首先對 OCT 包埋的組織進行冰凍切片,將切好的組織放置于組織優化玻片上的捕獲區域。接下來對組織切片進行固定,H&E 染色,用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片拍照,拍照完成后會繼續對組織切片進行通透處理,使細胞內的 mRNA 釋放出來,被玻片上的 oligo 所捕獲,在合成一鏈 cDNA 的時候,摻入帶有熒光基團的堿基,這樣合成好的 cDNA 就帶有熒光,接下來會通過酶消化去除玻片上殘留的組織,暴露帶有熒光的 cDNA,用 Cy3 通道的熒光顯微鏡,掃描整張片子,獲得熒光染色的圖片,組織優化的所有實驗都在玻片上完成。

基因表達實驗流程:    

先對 OCT 包埋的組織進行冷凍切片,將切好的組織切片放置于基因表達玻片上的捕獲區域。接下來對組織切片進行固定,H&E 染色,用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片進行拍照,獲得組織形態信息。拍照完成后會繼續對組織切片進行通透處理,使細胞內的 mRNA 釋放出來,被玻片上的 oligo 所捕獲,在玻片上進行一鏈和二鏈 cDNA 的合成,合成二鏈 cDNA 后會做變性處理,將合成好的二鏈 cDNA 回收到 ep 管中,后面的所有實驗都在 ep 管中完成,包括 cDNA 的擴增和文庫的構建??臻g基因表達實驗可以分為兩個部分,第一部分從組織固定到二鏈 cDNA 的合成,都是在基因表達玻片上完成。第 2 部分從 cDNA 的擴增到文庫的構建,都是在 ep 管中完成。


福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織是否與 Visium 兼容?

目前只有包埋在 OCT 中的新鮮冷凍組織經過了 Visium 空間基因表達解決方案的驗證。10X Genomics 的研發團隊成員正在積極研究 FFPE 組織相關的應用,并且已經獲得一些初步結果,推出適用于 FFPE 組織的實驗方案。


組織是否可經過 IHC 染色?

目前,Visium 空間基因表達流程是針對 H &E 染色而優化的。將 IHC 染色整合到此流程中是 10X Genomics 研發團隊積極研究的另一個領域,預計在 2020 年上半年推出。


H&E 染色是否會對樣本 RNA 質量產生影響?

不會,10X Genomics 官方實驗結果表明,H&E 染色不僅不會對樣本 RNA 質量產生影響,染色后還會提高基因檢測數。


組織或切片樣本的轉運?

運輸組織樣本:將凍存好的組織放在密封的容器中,再將裝有冷凍組織的容器用密封袋封好,放置于干冰中運輸,樣本到達目的地后迅速轉移到 -80℃冰箱保存。

運輸已經貼了組織切片的玻片:可以將玻片放置于密封的容器中,并將玻片固定好,再將裝有玻片的容器用密封的袋子封好,放置于干冰中運輸。同樣樣本到達目的地后,迅速轉移到 -80℃冰箱進行保存。這里還要注意,一旦玻片上貼好了組織切片,只能保存 7 天。


Visium 空間轉錄組目前不能夠做什么組織樣本?

在 10X 測試過的組織類型中,有三種組織還需要進一步的優化,包括樣本制備的優化和組織通透性的優化,分別是皮膚,胰腺和骨組織。

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Visium 空間轉錄組能夠做何種組織類型以及推薦切片厚度是什么?

10X Genomics 測試過很多組織類型,絕大多數都可以用于空間轉錄組的分析。下圖是他們官網上測試過的組織類型的列表,測試過的組織都可以運用在空間轉錄組的分析上面。但建議用戶用基因表達玻片做正式實驗前,務必用組織優化的玻片測試一下,看組織能否用于空間轉錄組的實驗,同時也找到最佳的組織通透時間。

切片厚度基本上以 10μm 為主,但也有少量組織例外。

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一張 Visium 空間基因表達玻片上可以運行不同類型的組織嗎?

可以,Visium 空間基因表達玻片上可以檢測不同類型的組織。每張玻片包含 4 個捕獲區域,因此一張玻片上最多可檢測四種不同類型組織的切片。每種組織的最佳透化時間需要通過組織優化(TO)實驗來預先確定,每種類型的組織使用一張 TO 玻片。


一個捕獲點可以捕獲不止一種類型的細胞嗎?

是的,根據組織中待研究的具體區域,帶條形碼的捕獲點可能覆蓋不止一種類型的細胞。具體取決于組織類型、組織內的細胞大小以及這些細胞的密度。研究人員可看到每個點大約捕獲 1 到 10 個細胞。您可以將每個捕獲點想象為一種“微型批量”的實驗,在這個實驗中,研究人員收集一小批細胞的平均基因表達數據。這是 10x Genomics 的研究團隊正在積極研究的另一領域,目的是盡量讓捕獲點變得更小。


如果有些捕獲區域未使用,那么 Visium 空間組織優化或基因表達玻片是否可以重復使用?

無論您在處理過程中是否使用了所有捕獲區域,玻片僅供一次性使用。這是因為流程中包含了多個步驟,包括對玻片進行染色、沖洗和重新干燥,這些步驟會破壞未使用的捕獲區域上的寡核苷酸條形碼,并降低其整體的靈敏度。


成像測試玻片的作用?

Visium 配件試劑盒中的成像測試玻片有兩個用途。

一,確定客戶的成像系統是否與 Visium 兼容。

二,用于成像程序的設置,以便在 Visium 組織優化和基因表達流程中獲取圖像。


如何確定組織切片的空間位置信息?

在捕獲區域四周有一圈由灰色小點組成的基準邊界,提供組織切片的空間定位信息。


Visium 空間轉錄組對測序讀長的要求?

Visium 空間轉錄組的文庫,可以在 Illumina 所有測序儀上測序,文庫的結構如下圖所示,需要雙端 index 測序。

建議的測序方式是為 Read 1:28 個 bp,i7 index:10 個 bp,i5 index:10 個 bp,Read 2:120bp。Read 1  用于測試 Spatial Barcode 和 UMI,Read 2 用于測試插入片段。不建議將 visium 的文庫與其他單 index 的 10x 文庫混合測序。

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Visium 空間轉錄組對測序深度的要求?

與單細胞實驗不同,我們無法根據細胞數計算空間轉錄組文庫的測序量,因為我們不知道組織切片當中有多少細胞,我們根據組織切片占捕獲區域的比例計算測序量,計算測序量的時候,只考慮被組織切片覆蓋的 spot,每個 spot 的推薦最低起始測序量是 5 萬個 read pairs,根據 H &E 染色的結果可以估算捕獲區域到底有多少百分比的 spot 被組織覆蓋。

計算測序量很簡單,比如我們假設一個組織覆蓋了捕獲區 50% 的面積,我們就用 0.5×5000×5 萬個 read pairs per spot,得出測序量是 125 個 million read pairs。這里面 0.5 就代表著覆蓋了捕獲區域 50% 的面積,5000 就代表著每一個捕獲區域總共有 5000 個 spot,再乘以 5 萬,5 萬就是每個 spot 我們推薦的最低測序的量,就是 5 萬個 read pairs per spot。測序量與組織大小、組織類型和基因表達水平相關。


在分析數據時是否需要編程或生物信息學的經驗?

通常,研究人員需要具備一點點生物信息學經驗來使用 Space Range。Space Range 流程在 Linux 服務器上運行;這就需要研究人員了解基本的命令行操作,以及如何登錄和退出 Linux 服務器。不過,在大多數情況下,Space Range 是高度自動化的。讓軟件正常運作的文件和算法都已經包含在內。因此,研究人員只需在測序后將兩個輸入文件提供給 Space Range,讓軟件生成空間基因表達數據。

Loupe Browser 有著完全圖形化的界面,并且根本不需要編程。不過,您在研究過程中可能會碰到某個時刻,比如想了解空間基因表達數據的一個具體問題,或者創建一個自定義圖形。那么,這就需要您學習 R 語言或其他腳本編程語言。


我已經對舊版本的空間轉錄組學(Spatial Transcriptomics)數據進行了測序,可以用 Space Range 和 Loupe Browser 來分析這些數據嗎?

抱歉,不可以。因為數據類型不同,它們無法兼容。如果您有這種類型的數據,仍然建議您使用現有的處理空間轉錄組學數據的分析流程。


是否有類似于 Seurat 的第三方 R 語言工具來分析空間基因表達數據?

沒錯!事實上,分析空間基因表達數據的第三方工具的數量正在迅速增長。目前的一些選擇包括 Spaniel 和 Giotto。Seurat 也是一種選擇。Space Range 流程的輸出矩陣與 Cell Ranger 的 Feature Barcode 輸出矩陣的格式相同。研究人員可將此輸出文件直接輸入 Seurat 中進行進一步的分析。您可以通過 https://satijalab.org/seurat/v3.1/spatial_vignette.html 了解 Seurat 流程處理空間基因表達數據的更多信息。

此外,10x Genomics 的計算生物學家還創建了 R 資源,可以幫助客戶對其樣本開展深度分析。這些 R 資源讓研究人員能夠一次觀察多個基因、樣本或特征,如基因、UMI 和聚類。如果研究人員想分析不同特征的樣本,或不同實驗條件下的樣本(如野生型、患病和治療中的樣本),這可能特別有用。您可以在我支持網站上訪問這些 R 資源(https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/rkit)。


伯豪生物 空間轉錄組測序服務優勢

高質量切片:切片、貼片經驗豐富,針對不同組織優化了解決方案。

流程化分析:完善的分析流程,準確快速解析空間轉錄組數據。

標準化內控:豐富的實操經驗構建了標準化的內控體系。

專業化團隊:資深的技術團隊具有多年項目方案設計、實驗操作、售后分析等經驗。

全流程服務:提供組織冷凍包埋、貼片、切片、透化、建庫測序及數據分析的全套服務。


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