表觀組-焦磷酸測序

焦磷酸測序介紹

焦磷酸測序技術(pyrosequencing)是由DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurytase)、熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase) 這4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。它是單個或多個特定甲基化位點定量檢測的金標準，是高通量甲基化測序和芯片較為理想的驗證方法，另外，焦磷酸測序還可以定性檢測SNP。

技術原理

1. 在每一輪測序反應中，待測樣本的反應體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)；
2. 互補的堿基結合在模板上時，會釋放出一個焦磷酸基團Pyrophosphate (PPi)；
3. 在ATP 硫酸化酶的作用下，生成的PPi 可以和APS 結合形成ATP；
4. 在熒光素酶的催化下，生成的ATP 又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光；
5. 光信號被CCD數碼相機捕捉，經過軟件處理后，獲得一個特異的檢測峰；
6. 反應體系中剩余的dNTP 和殘留的少量ATP 在Apyrase 的作用下發生降解；
7. 待上一輪反應完成后，加入另一種dNTP，使上述反應重復進行。

服務流程

1. 方案確定與專業的引物設計評估
2. 合同簽訂與送樣
3. 樣本抽提質檢
4. 引物合成與預實驗
5. 亞硫酸鹽轉化與純化
6. PCR擴增與純化（有一端引物帶有生物素標記，擴增出包含測序序列的區域，擴增后用鏈霉親和素磁珠純化。）
7. 焦磷酸測序
8. 數據分析

樣品要求

1. 濃度>25ng/μl，總量>500ng（起始量根據每個樣本要做的反應數可適當調整）；
2. OD260/280=1.6-2.0，OD260/230>1.5；
3. 電泳主帶清晰，無明顯降解；
4. 無蛋白和RNA污染；
5. 特殊樣本，如FFPE等，可以降低條件，但是有風險。

儀器平臺

• Qiagen PyroMark Q96 ID實時定量焦磷酸序列分析儀

應用案例

焦磷酸測序檢測宮頸癌中UTF1啟動子區域甲基化水平

研究者利用Illumina Human Methylation27芯片對9例樣本（4例正常，5例宮頸癌）進行全基因組啟動子區甲基化掃描，結果顯示宮頸癌患者UTF1啟動子區域呈現出高的甲基化狀態。為了驗證芯片篩選的結果，采用焦磷酸測序方法首先對這些樣本的UTF1啟動子區域進行深入分析，結果表明正常宮頸中UTF1啟動子區域呈現低甲基化狀態，而相同的位點在SCC中呈現高甲基化狀態。為了進一步驗證，研究者擴大樣本量，對47例不同類型的石蠟包埋組織樣本及10例白細胞進行焦磷酸測序檢測，與之前的結論保持一致。結合RNA水平和蛋白水平的實驗，研究者后提出UTF1啟動子甲基化狀態可以作為宮頸癌診斷的一個重要的分子標志物。

原文：Aberrant Promoter Methylation and Expression of UTF1 during Cervical Carcinogenesi. Plos One. 2012 ,7(8):e42704.